Här nedan följer en maskininläst version av artikeln. Observera att det saknas styckeindelning, radbrytningar, mellanslag efter skiljetecken och att det kan förekomma stavfel.
Experimentella
studier med in vivo- och in vitro-modellerSammanfattat* 15 års in vivo- och in vitroforskningsresultat kring östradiolets verkningsmekanismer i humana endometriala adenokarcinom .* Resultaten analyseras i relation till östrogensubstitution hos kvinnor med existerande men odiagnostiserad endometriecancer .* Våra resultat tyder på att östradiol har en gynnsam effekt på tumörprogression med avseende på differentieringsgrad , tillväxt och tillväxtreglering .Hormonet kan bromsa upp den genetiskt determinerade progressionen men inte stoppa den .* De experimentella studierna kunde inte visa några effekter av östrogenbehandling , som i klinisk praxis skulle innebära ökade risker för en försämrad överlevnad för patienter med odiagnostiserad endometriecancer .Syftet med detta arbete , i vilket jag sammanfattar min egen och mina medarbetares forskning från de senaste åren , är att belysa östradiolets roll i progression av humana endometriecancrar och därmed möjligen bidra till diskussionen
om östrogensubstitution .Problemet aktualiseras av en ökande östrogenkonsumtion bland kvinnor i klimakteriet och även långt in i postmenopaus .Statens beredning för utvärdering av medicinsk metodik ( SBU ) analyserade 13 utvalda studier i frågan 1996 [ 1 ] .Man slår fast att risken för endometriecancer ökar efter östrogenbehandling utan gestagentillägg .Förutom gestagentillägg är det dosen för östrogen och behandlingens längd som kan påverka cancerrisken .De epidemiologiska studier som SBU-rapporten är baserad på behandlar enligt min uppfattning två separata processer samtidigt utan att de definieras , nämligen östrogensubstitutionens roll för uppkomsten av cancer och för progressionen av redan utvecklad men ännu inte diagnostiserad endometriecancer .Detta är naturligt i den typ av studier där man undersöker resultatet av en ofta flera år lång exogen hormontillförsel .Att studierna är svårvärderade kan även förklaras med ett mörkertal av kvinnor som har odiagnostiserad endometriecancer
redan när de börjar med substitution .Östradiolets påverkan inte helt klarlagdFrågan om hur östradiol , och enligt senaste rapporten även östriol , påverkar uppkomsten av endometriecancer är ännu inte riktigt klarlagd , men hormonet har först klassats som ko-karcinogen och senare som karcinogen .Det är ännu mindre belyst , fast frågan är lättare åtkomlig för forskning , hur endogen och exogen östradiol påverkar redan utvecklade endometriecancerceller .Det finns nämligen två situationer där det kan inträffa att både patienten och läkaren ovetande om redan existerande malignitet i endometriet överväger att påbörja eller att fortsätta hormonbehandlingen .För det första vet vi idag , grundat på experimentella resultat och teoretiska beräkningar , att maligna celler finns i endometriet under cirka tio år innan diagnosen ställs [ 2 ] .Under de åren , oftast kring klimakteriet , pågår naturliga förändringar i kroppens hormonproduktion , varför behovet av substitution ökar just under
denna period .För det andra tycks ett problem , som ofta diskuterats , vara östrogensubstitution efter avslutad behandling av corpuscancer eftersom en klinisk komplett remission inte nödvändigtvis innebär frånvaro av maligna celler .Även här är man hänvisad till att huvudsakligen gå efter epidemiologiska studiers resultat .Genom att sammanfatta resultaten av flera års laboratorieforskning samt genomgången relevant litteratur hoppas vi kunna bidra med användbar bakgrundsinformation till kända epidemiologiska studier och inte minst SBU-rapporten .Ökade kunskaper om östrogenreceptorerSteroidhormoner binder sig till sina specifika receptorer och spelar en viktig roll för uttrycket av olika hormonresponsiva gener i eukaryota celler .Hormonmolekyler binder sig direkt till de intranukleära , nativa s k icke-aktiverade receptorer som är löst bundna till specifika sekvenser ( hormone responsive elements , HRE ) som finns på s k promotorregioner på östrogenkänsliga gener .Detta hormon och receptor
i homodimerkomplex aktiverar receptorn genom fosforylering så att dess bindningsaffinitet till DNA ökar .Aktiverade receptorer påverkar i sin tur syntesen av specifika mRNA och proteiner ( progesteronreceptorer , PgR , samt andra intra- och extracellulära proteiner , bl a tillväxtfaktorer ) som är involverade i regleringen av både cellproliferation och differentiering [ 3 ] .Våra kunskaper om östrogenreceptorer har under senare år ökat ytterligare .Vi vet nu att ERa -genen är lokaliserad på kromosom 6q25 .1 [ 4 ] .Green har sekvenserat humant cDNA , framställt från MCF-7 bröstcancercellinje , och visat att genen producerar ett protein med 66kD-längd [ 5 ] .Funktionell analys av receptorprotein visade att det har sex olika regioner kallade A – F , varav regionerna A/B ansvarar för transkription ( AF1 ) , C är regionen för DNA-bindning som genom D kopplas ihop med region E som i huvudsak ansvarar för hormonbindningen , medan delar av region F och delar av region E står för transkriptionsaktivering
( AF2 ) samt för dimerisation .AF1 och AF2 samverkar med varandra vid aktivering av transkription , men de kan även ligandaktiveras separat på en cell eller på ett promotorberoende sätt [ 6 ] .Koncentrationen av östrogen- och progesteronreceptorer spelar sedan flera år en viktig roll i klinisk praxis för prognosbedömning och även för utformningen av terapi för patienter med bröst- och endometriecancer .Östradiol ändrar tumörcellens proliferation och tillväxtHormonbehandling ( med progestagener eller antiöstrogener ) av humana endometriecancrar ger ett objektivt tumörsvar hos 30-40 procent av tumörerna trots att 80 procent innehåller ERa och 50 procent PgR [ 7 ] .Den låga responsfrekvensen kan förklaras med att ett stort antal tumörer progredierar under behandlingens gång från hormonkänslig till hormonresistent form .In vivo-studier i första hand genomförda på MCF-7 , en bröstcancer cellinje , har visat att avseende östradiolkänslighet och tillväxtreglering sker progression
stegvis [ 8 ] .Östradiolrelaterade tumörer progredierar från hormonberoende , dvs då tumören enbart växer i närvaro av hormon , till hormonresistens via ett intermediärt stadium där tumören växer till oberoende av hormon , men där tillförsel av östradiol ändrar tumörcellernas proliferation och tillväxt [ 8 ] .Dessa studier har emellertid inte kunnat ange vilka faktorer som påverkar förloppet av progression .Man fann vissa indikationer för att även tillväxtregleringen förändras under progression , dvs regleringen av samspelet mellan proliferation och cellförlust ändras .Tillväxtregleringen i humana endometriecancrar har tidigare inte studerats , sannolikt beroende på svårigheten att etablera cellinjer i in vivo- och in vitro-modeller .Enligt vår kännedom finns endast vår in vivo-modell beskriven för experimentella studier av östradiolrelaterad tumörtillväxt och tumörprogression i humana endometriecancrar [ 9 , 10 ] .In vitro-studier av liknande slag har heller inte publicerats .RESULTATAV
IN VIVO-STUDIERI vårt in vivo-system , där humana endometriecancrar serietransplanteras till nakna möss , har vi observerat att koncentrationen av icke-aktiverad ERa dramatiskt minskar efter de första passagerna i möss .Fortsättningsvis leder flera års växt i nakna möss till en långsam men kontinuerligt sjunkande receptorkoncentration .ERa s rollVå r konklusion är att den låga östradiolkoncentrationen i honmöss ( < 10 pg/ml plasma ) , i vilken våra tumörer växer , jämfört med den hos postmenopausala kvinnor ( medelvärde : 25 pg/ml plasma ) är orsaken till den initialt snabba minskningen av ERa -halten .En ökning av hormonkoncentrationen genom östradiolbehandling av tumörbärande möss ökar enbart koncentrationen av aktiverad ERa men inte den totala ( icke-aktiverad + aktiverad ) ERa -koncentrationen , vilket man tidigare har antagit [ 10 ] .Vi har i flera långtidsexperiment studerat olika östradiolkoncentrationers effekt på ERa -aktivering och PgR-induktion som möjliga mått på tumörernas
östradiolkänslighet .Dessa experiment har visat att tumörer som växer i högre ( 100-150 pg/ml plasma ) östradi- olkoncentration har en ökad kapacitet att aktivera ERa och inducera PgR , jämfört med samma tumör som växt parallellt i kastrerade möss med låg [ < 5pg/ml plasma ) östradiolkoncentration .Vi tolkar dessa resultat som ett uttryck för bibehållen , relativt hög östradiolkänslighet för den förstnämnda tumören .Tumörer som växer i låg hormonkoncentration förlorar däremot successivt förmågan att kunna aktivera ERa och inducera PgR , dvs dessa tumörer progredierar till ett hormonresistent tillstånd [ 10 , 11 ] .Sammanfattningsvis har vi kunnat konstatera att östradiolbrist kan påskynda den naturliga tumörprogressionen , medan hög östradiolkoncentration bromsar upp samma process men inte kan stoppa den helt .Östradiolnivåer påverkar ERa -funktion , sannolikt som en del i hormonell reglering .Information om cellkinetik och tillväxt ( volymökning )För att kunna studera förändringar
i cellkinetik och tillväxt genom tumörprogression , vore det idealiskt att följa östradiolberoende endometriecancrar under flera år till dess att växtsättet progredierat till östradiolberoende och resistent fenotyp .Hittills har dock alla försök att etablera östradiolberoende endometriecancrar hos nakna möss misslyckats [ 9 , 12 ] .En sannolik förklaring till detta är att östradiolberoende cellkloner selekteras bort under etableringen av tumören , till stor del beroende på de låga östradiolnivåerna hos djuren .Våra resultat från studier gjorda på endometriecancrar bekräftar dock tidigare erfarenheter från humana och murina brösttumörer att tillväxten för hormonberoende fenotyp progredierar till hormonoberoende och resistens via ett intermediärt stadium där tumören växer hormonoberoende men tillförsel av hormonet kan öka tillväxten .Våra experiment har gett vidare information om detta intermediära stadium och klargjort att östradiol kan accelerera tillväxten ( volymökningen ) hos vissa
endometriala tumörer men dämpa den hos andra [ 13 ] .Då ERa -aktiveringen i båda fallen var av samma intensitet ( se ovan ) , tolkar vi resultaten som att det föreligger en skillnad i tillväxtregleringen på postreceptornivå ( translations- eller posttranslationsnivå ) .Någon närmare specificerad förklaring till de erhållna resultaten har vi emellertid inte kunnat ge .Flera av våra experiment har visat att olika östradiolkoncentrationer kan påverka uttrycket av p53- och Rb-protein i humana endometriecancrar som växer i nakna möss .Fyndet har inspirerat oss att undersöka dels en möjlig koppling mellan östradiolkoncentrationer och p53-uttryck , dels proteinets eventuella roll i tillväxtregleringen för att på så vis hitta en förklaring och möjligen lokalisera de postreceptorförändringar vi tidigare nämnde .I dessa experiment har vi använt endometriecancrar som uttrycker wildtype p53 , vilket dels fastställdes genom sekvenseringen av exon 5 , 6 , 7 , 8 på - 53-genen , dels med hjälp av immunhistokemisk
undersökning med ( Pab 240 ) mutant specifik monoklonal antikropp .Resultaten från det första experimentet visar att ökande östradiolkoncentrationer ökar p53-uttrycket , medan minskande hormonnivåer minskar det .Det ökade p53-uttrycket leder i sin tur till en ansamling av celler i G1-fasen och en tendens till lägre proliferationshastighet .I en annan experimentserie fann vi att östradiolbehandling av en östradiol- oberoende men känslig endometriecancer leder till ökat p53-uttryck med samtidigt minskat uttryck av bcl-2-protein .Då behandlingen resulterade i en förlängd tumördubblingstid , dvs långsammare tillväxt samtidigt som den beräknade cellförlustfaktorn ökade utan förändringar i cellproliferationen , anser vi att den minskade bcl-2-koncentrationen resulterat i en ökad apoptos som vi mätte som ökad cellförlustfaktor .I en annan tumör , med lägre hormonkänslighet men med fungerande ERa -system resulterade östradiolbehandlingen i ökat p53-uttryck men ingen förändring
i bcl- 2-uttryck eller cellförlust , vilket ledde till oförändrad tillväxt ( volymökning ) .I detta experiment använde vi flera olika östradioldoser , och resultatet visade att p53-uttrycket korrelerade väl med de olika doserna .I den tredje tumören , som var östradiolresistent , med detektabla men icke aktiverbara ERa påverkade östradiolbehandlingen inte uttrycket av ovan nämnda gener och inte heller tumörtillväxten .Vi tolkar våra sammansatta resultat som att östradiol kan reglera p53-uttrycket som i sin tur påverkar bcl-2-produktion .Genom p53-bcl-2-kopplingen kan hormonet reglera både cellkinetik och tillväxt ( volymökning ) i humana endometriecancrar som växer i nakna möss .Reglering av p53 är östradioldosrelaterad och ett fungerande ERa - system är en förutsättning för denna typ av reglering som sannolikt har störst betydelse vid endometriecancer i det intermediära stadiet med östradioloberoende men känslig tillväxtfenotyp [ 14 ] .I olika experiment har vi använt omväxlande diploida
och aneuploida tumörer utan att kunna se någon skillnad i tumörernas progression .Vi tolkar detta som att de kvantitativa DNA-avvikelserna som förekommer just i våra etablerade tumörer inte påverkade de parametrar vi undersökte .RESULTATAV IN VITRO-STUDIERFör att ytterligare kunna studera och klarlägga östradiolets effekter på tillväxtreglering och progression har vi från en av våra in vivo växande tumörer etablerat en kontinuerligt in vitro växande cellinje och karaktäriserat denna .In vitro-etablering av kontinuerligt växande endometriecancerlinjer har visat sig vara vansklig , vilket också avspeglas i det begränsade antal linjer som finns rapporterade .Som vid etableringen av in vivo-tumörer är selektionstrycket högt , och det är därför svårt att erhålla intakt receptorfunktion samt hög differentiering .Vid karaktäriseringen av in vitro-cellinjen fann vi vid sekvenseringen av p53-genen att denna muterat på två positioner , kodon 175 samt 248 , vilket resulterat i ett protein med
ökad halveringstid och spårats som överuttryck av proteinet med Western blotting .Detta gav oss ett intressant instrument för att jämföra den hormonella regleringen av ursprungstumören och vår p53-muterade linje .I ett första experiment tillförde vi en hög dos östradiol , vilket resulterade i en tillväxtretardation med ökad celldubblingstid .Detta talar för en bevarad fenotyp jämfört med ursprungstumören .Cellkinetiskt såg vi ett annat mönster .I stället för en ökad cellförlust med ökat uttryck av p53 och minskat uttryck av bcl-2 som ursprungstumören , reglerades tillväxtretardationen med en minskad S-fasfraktion och ökad andel celler i G1 , således en minskad proliferation .Ytterligare analys visade att G1-blockeringen sannolikt medieras via WAF1/CIP1 , en cdk-inhibitor .Vi tolkar detta som att det sannolikt existerar ytterligare östradiol-ERa -medierade mekanismer för den inhiberade tillväxtregleringen , som träder i kraft när p53 muterat .Vi studerade vidare östradiolets effekt under
längre tid , och behandling gavs i sex månader parallellt med en icke-behandlad kontroll .Resultaten visar att vi med denna långvariga behandling åstadkommer en selektion av en sublinje med ändrade tillväxtegenskaper och proteinuttryck .Den behandlade linjen växer efter sex månaders behandling långsammare än kontrollcellerna och har en lägre proliferation med sänkt S-fas-fraktion och ökad -WAF1/CIP1- medierad G1-blockering .Dessutom ses ett med tiden successivt minskat uttryck av proteinet bcl-2 , vilket talar för ökad apoptos .Tar man bort östradiol resulterar det i en viss , men inte signifikant , tillväxtökning , vilket talar för att denna subpopulation är östradiolresistent [ 15 ] .DISKUSSIONVåra samlade erfarenheter från de diskuterade studierna , i vilka vi undersökt några tilltänkta regleringsmekanismer för cellproliferation och tillväxt , visar tydligt att östradiol har en gynnsam effekt på progression av redan existerande endometriecancer både in vivo och in vitro .Vi anser
att den process vi studerat kan ge tumörbiologisk förklaring rörande observationer från epidemi- ologiska studier som funnit att det efter östrogensubstitution hos patienter ofta utvecklas högt differentierad tumör med god prognos [ 16 ] .Relaterat till klinisk praxis kan således de erhållna resultaten ha betydelse för tumörer som redan existerar men ännu inte är verifierade , även om vi är medvetna om att flera andra faktorer , som inte är undersökta i våra studier , kan influera tumörens utveckling .I experimenten använde vi övervägande ERa -positiva endometriecancrar med östradioloberoende men känslig ( inhiberad ) fenotyp .Kliniskt är detta sannolikt den oftast förekommande formen , innefattande tumörer med alla differentieringsgrader med medelhög och låg ERa -koncentration , uppskattningsvis kring och under 100 fmol/mg DNA .Det existerar ytterligare två förhållningsformer till hormonet som kan vara intressanta i sammanhanget , nämligen ERa -positiva tumörer med högt ERa - innehåll
: a ) östradiolberoende och b ) östradioloberoende men känsliga ( stimulerade ) fenotyper .Dessa tumörer är svåra att etablera såväl in vivo som in vitro , varför det knappast finns utvärderingsbara forskningsresultat att gå efter .Tumörer med låg differentieringsgrad tillhör sannolikt dem som är östradioloberoende men av inhiberad fenotyp , ifall de har funktionsdugliga ER eller är helt okänsliga för hormonet .Kloning av cDNA för en ny receptor , ERb , har visat komplexiteten av cellernas respons till östradiol [ 17 ] .Allmänt ERb kan influera östradiolets intracellulära effekt genom två olika sätt : a ) direkt genom att bilda ERb -homodimer , b ) indirekt genom att modulera ERa - funktion via ERa /ERb -heterodimer .ERb är en negativ regulator av ERa - medierad transkription , en funktion som är beroende av ERa /ERb -förekomst i samma cell samt östradiolkoncentration [ 18 ] .Fakta är emellertid att ERb uttrycks i låga koncentrationer både i endometrium och i humana endometriecancrar
.Våra resultat visar dessutom att östradi- olets tillväxtdämpande effekt existerar även i in vivo- och in vitro-cellinjer utan mätbart ERb -protein .De ovan nämnda observationerna talar för att hormonets tillväxtdämpande effekt huvudsakligen förmedlas via ERa .Efter beskrivning av ERa -varianter vid bröstcancer [ 19 ] , visade även senaste årens experiment på endometriecancrar , utförda i vårt laboratorium , förekomst av ERa -varianter på mRNA-nivå , i första hand inom exoner vars funktion är att binda hormonet .Förutom varianter av ERa -mRNA , kunde vi i de flesta endometriecancrar konstatera att det parallellt med expression av 66kD lång wild-type ERa även uttrycks ett kortare 52kD-protein .Vi har funnit att monoklonala antikroppar riktade mot karboxy- , hinge- och aminoterminal av wild-type ERa även kan binda sig till det kortare 52kD-proteinet .Det sistnämnda binder sig dessutom till samma HRE-sekvens som wild-type ERa .Resultat från delexperimenten tyder på att tillförsel av östradi-
ol eller tamoxifen påverkar det kvantitativa uttrycket av och relationen mellan 66kD ( wild-type ERa ) och 52kD-protein i samma tumör på ett ligandberoende sätt .Det sistnämnda preliminära resultatet samt en ännu inte helt klarlagd vävnadsspecifik roll av ERb understryker komplexiteten av den östrogenrelaterade regleringen av endometrium och endometriecancer .Ökade kunskaper om funktionen hos ERa , ERb , mRNA och proteinvarianter kommer säkerligen att bidra till en mer komplett möjlighet att värdera östrogensubstitution .Sammanfattningsvis kunde våra in vitro- och in vivo-resultat inte visa några effekter av östrogenbehandling som i klinisk praxis skulle innebära ökade risker för patienter med odiagnostiserad endometriecancer så att deras tumörbehandling påverkas ogynnsamt eller att överlevnaden försämras .Progesterontillägget , administrerat parallellt och kontinuerligt med östrogen för patienter som har uterus kvar , är sannolikt mest gynnsamt för patienten och minskar effektivt
endometriecancerincidensen [ 20 ] .
