Lhx2 tycks hindra uppkomst av levercirros

Levercirros, eller skrumplever, kan ses som slutstadiet av en kronisk leversjukdom när levern inte längre klarar av att freda sig mot den skadliga retningen. Vid cirros kan levern inte längre fullgöra sina mycket viktiga funktioner, tex att detoxifiera skadliga ämnen, producera galla, reglera glukoshalten i blod och tillverka en rad olika proteiner.
När symtom på levercirros uppträder är de oftast antingen relaterade till nedsatt syntetiserande eller detoxifierande förmåga (vätskeretention, encefalopati), portahypertension (esofagusvaricer, ascites) eller ospecifika såsom trötthet, klåda, impotens, gynekomasti och osteopeni.
Risken att utveckla primär levercancer (hepatocellulär cancer) är kraftigt ökad vid levercirros [1], och levercirros är dessutom den främsta indikationen för levertransplantation.
Risken att utveckla cirros varierar stort för olika orsaker och mellan olika individer, varför man har antagit att genetiska faktorer spelar en betydande roll.

Levercirros – ett världsomspännande hälsoproblem
Levercirros föregås av en period (som varar från några år upp till decennier) av förhöjd bindvävsbildning, dvs leverfibros. Under denna period kan levern kompensera för bindvävsbildningen genom att kontinuerligt bilda nya leverceller och genom sin stora överkapacitet.
Till slut klarar levern inte av att kompensera längre, utan levercirros (efter grekiska kirrhos, gulröd) har utvecklats, och levern består då till stor del av enbart bindväv och regenerationsnoduli av nybildade leverceller med nedsatt funktion. Man kan därför betrakta levercirros som resultatet av en kronisk sårläkning som går över styr. Fibros graderas i fyra olika stadier, där cirros är stadium 4 (Figur 1).
I Fakta 1 är de vanligaste orsakerna till levercirros listade efter förekomst i Sverige. På senare tid har en ny och alarmerande snabbt ökande orsak börjat märkas, nämligen fetma i kombination med typ 2-diabetes (det sk metabola syndromet) [2]. Detta tillstånd, icke-alkoholorsakad steatos (NASH, non-alcoholic steatohepatitis), leder ofta till leversteatos med inslag av inflammation, vilket i sin tur kan leda till leverfibros och efterföljande cirros; icke-alkoholorsakad steatos kan utgöra en stor del av de kryptogena cirroserna [3]. Denna leversjukdom kan även drabba överviktiga barn [4].
Tidigare har levercirros uppfattats som ett irreversibelt tillstånd, men senare data från behandlingsbara leversjukdomar (autoimmun hepatit, hepatit C) talar för att cirros är ett mer dynamiskt tillstånd, som kan gå i regress om skadeorsaken kan behandlas [5].
Levercirros är redan idag ett enormt och världsomspännande hälsoproblem och är en av de tio främsta dödsorsakerna i västvärlden. Denna sjukdom drabbar dessutom ofta personer i arbetsför ålder, vilket leder till extra stora kostnader för samhället.
Eftersom fetma dessutom ökar explosionsartat i västvärlden och anses som en epidemi kommer detta sannolikt att leda till motsvarande ökning av levercirros inom en snar framtid [6].
En ökad förståelse på molekylär och cellulär nivå av de mekanismer som orsakar bindvävsbildningen är därför nödvändig för att kunna hitta nya och effektiva behandlingsmetoder.

Ökad bindvävsbildning den gemensamma nämnaren
Den gemensamma nämnaren för alla dessa sjukdomar som kan orsaka levercirros är ökad bindvävsbildning i levern. Detta betyder att det finns gemensamma mekanismer på molekylär och cellulär nivå som leder till levercirros. Men för att kunna förklara dessa krävs kunskap om leverns cellulära uppbyggnad och organisation [7].
De celler i levern som utför metabola funktioner är hepatocyter, vilka utgör cirka 80 procent av leverns totala volym. Om man tittar på den minsta organisatoriska enheten i levern, en sk leverlobulus, som är ungefär 1 mm i diameter (Figur 2), är hepatocyterna organiserade i parallella plattor.
Blod som kommer från tarmen via portavenen passerar genom sinusoiderna till centralvenen. Galla produceras av hepatocyterna och transporteras i motsatt riktning i små gall-canaliculi mellan hepatocyterna ut till små och allt större gallgångar. Sinusoider är en typ av blodkärl där endotelcellerna har unika porer för optimal interaktion mellan blod och hepatocyter. I sinusoiderna finns även Kupfferceller, som är en typ av makrofag med dess funktioner, dvs fagocytär funktion och sekretion av cytokiner.

Stellatceller har central funktion
Mellan sinusoidernas blodkärlsvägg och hepatocyterna finns ett mellanrum som kallas Disses spatium, och här finns en celltyp som benämns stellatceller. Funktionen av dessa celler i en normal lever är inte helt klarlagd, men stellatceller lagrar en stor del av kroppens vitamin A och har även kallats vitamin A-lagrande eller fettlagrande celler.
Dessa celler är centrala i förloppet som kan leda till levercirros, eftersom de oberoende av vad som utlöst sjukdomsförloppet genomgår en aktivering, vilket startar bindvävsbildningen [9].
Stellatceller aktiveras vid vävnadsskada, och de retningar/signaler som kan aktivera vilande stellatceller har studerats under lång tid. Bland annat utsöndrar Kupfferceller, som blir aktiverade under den initiala inflammatoriska processen vid vävnadsskada, cytokiner, tex tumörnekrosfaktor α (TNFα) och transformerande tillväxtfaktor β (TGFβ), vilket i sin tur bidrar till aktiveringen av stellatceller [10]. Hur dessa signaler tolkas och regleras i stellatcellen har däremot varit relativt okänt.
En stellatcell som blir aktiverad genomgår många förändringar på cellulär och molekylär nivå (Figur 3). Den mest uppenbara förändringen är att den börjar producera ett överskott av extracellulära matrixproteiner som bygger upp bindväven, tex fibronektin, laminin och olika typer av kollagener som det normalt finns ytterst lite av i levern. Denna förändring leder bla till att porerna i sinusoidernas endotelceller försvinner, sk kapillarisering, vilket i sin tur leder till försvårad interaktion mellan blodet och hepatocyterna.
Stellatcellerna får även egenskaper som liknar dem hos glatt muskulatur, eftersom de börjar uttrycka gener som normalt är associerade med dessa celler, tex α-smooth muscle actin (ASMA).
Andra tydliga förändringar är att aktiverade stellatceller tappar sitt vitamin A-innehåll och börjar producera tillväxtfaktorn PDGF (platelet derived growth factor), som stimulerar dess egen proliferation [9].
Det är aktiveringen av stellatcellen som är gemensam för fibrosutvecklingen, oavsett bakomliggande sjukdom. Vilka mekanismer som reglerar aktiveringsprocessen i stellatcellen har hittills varit relativt okända. En ökad förståelse för denna process skulle kunna underlätta utvecklingen av nya, effektivare läkemedel.
Sådana läkemedel skulle kunna antingen hämma utvecklingen av fibros eller, ännu hellre, vända tillbaka hela förloppet i en cirrotisk lever, eftersom det nu är känt att detta tillstånd kan vara reversibelt.

Lhx2 upptäcks ha en aktiv roll i stellatceller
De upptäckter som är relevanta för levercirros kom utifrån helt grundvetenskapliga analyser av utvecklingen av levern under fosterstadiet. Intresset var speciellt riktat mot genen Lhx2 (LIM-homeoboxgen nr 2), eftersom den är inblandad i utvecklingen av levern. Proteinet som denna gen ger upphov till är en transkriptionsfaktor, dvs den reglerar uttrycket av andra gener.
Tidiga resultat visade att Lhx2 är aktiv i levern under fosterutvecklingen och att den är viktig för leverutvecklingen, eftersom möss som hade denna gen utslagen hade en mindre lever än normala möss. Leverdefekten i de muterade mössen ledde till letal anemi under fosterutvecklingen, eftersom levern vid detta utvecklingsstadium i princip enbart är ett blodbildande organ.
Det var dock okänt varför leverutvecklingen var defekt hos de muterade mössen, och man visste inte i vilken celltyp som Lhx2 är aktiv. Det första steget var därför att bestämma i vilken celltyp som Lhx2 är aktiv, och eftersom ett fåtal celler med speciell morfologi, ungefär 5–10 procent av totala antalet celler i levern, uttrycker Lhx2 kunde vi utesluta att genen är aktiv i hepatocyter hos både vuxna individer och foster.
Sedermera gick det att påvisa att Lhx2 är aktiv i stellatceller, eftersom celler som uttryckte Lhx2 även uttryckte ett flertal gener som är typiska för stellatceller [11, 12].

Lhx2 fungerar som »broms«
När vi hade fastställt att Lhx2 är aktiv i stellatceller började vi leta efter typiska tecken på leverfibros hos dessa musfoster, eftersom förändrade stellatceller är så intimt kopplade till denna sjukdom. När denna aspekt analyserades började saker och ting att falla på plats.
Levern hos de muterade mössen hade tydligt förhöjt innehåll av olika extracellulära matrixproteiner, tex kollagen typ I, III och IV, fibronektin och laminin. Denna förändring var progressiv och skedde mycket snabbt i de muterade mössens levrar. Måttligt förhöjd deposition av extracellulära matrixproteiner kunde observeras dag 12 i fosterutvecklingen, och redan 2 dagar senare var levern helt fylld av extracellulära matrixproteiner (Figur 4A). Detta sjukdomsförlopp tar normalt år och till och med decennier hos vissa patienter, emedan dessa muterade möss visade en tydlig sjukdomsutveckling på 2 dagar.
Aktiverade stellatceller uttrycker ASMA, och vi kunde även visa att en majoritet av stellatcellerna i levern hos de muterade mössen uttrycker denna gen, medan stellatcellerna i en normal lever inte uttrycker ASMA.
Vi kunde även se ett nästan fem gånger så starkt uttryck av den tillväxtfaktor (PDGF) som stimulerar tillväxt av stellatceller i de muterade levrarna som i normal lever. Däremot var det inget ökat uttryck av TNFα eller TGFβ i de muterade levrarna, vilket skulle kunna betyda att det mest troliga var att Kupfferceller inte bidrog till aktiveringen av stellatceller [12].
Dessa observationer tyder på att Lhx2 under fosterutvecklingen fungerar som en sorts »broms« i stellatceller för att de inte skall aktiveras. Tar man bort denna »broms«, dvs inaktiverar Lhx2, leder detta till att stellatcellerna spontant aktiveras och startar hela det förlopp som kan leda till levercirros [12].
Om denna tolkning att Lhx2 kan fungera som en »broms« för aktiveringen av stellatceller är korrekt, kanske även Lhx2 skulle kunna »bromsa« en redan aktiverad stellatcell och göra den mindre aktiv.
För att analysera detta använde vi oss av en stellatcellslinje som etablerats från lever i människa, dvs celler med stellatcellslika egenskaper och som går att odla i cellkultur. Denna stellatcellslinje har de flesta egenskaper som en aktiverad stellatcell har, bla hög produktion av extracellulära matrixproteiner och uttryck av ASMA. Om Lhx2 kunde fungera som en »broms« skulle uttryck av Lhx2 i denna stellatcellslinje leda till att de karakteristika som är typiska för aktiverade stellatceller minskar.
När vi förde in Lhx2-genen i denna humana stellatcellslinje var det just detta vi såg, eftersom uttrycket av det extracellulära matrixproteinet kollagen typ I och aktiveringsmarkören ASMA gick ner med 45–65 procent inom 24 timmar (Figur 4B) [12].
Dessa resultat indikerar att de observationer vi gjorde i möss har relevans även för människa.

Möjligt att »kortsluta« den process som leder till levercirros
Funktionen av Lhx2 i stellatceller och dess roll i utvecklingen av levercirros är sammanfattad i Figur 5. När Lhx2-genen är aktiv i en stellatcell håller den sig vilande och utför den funktion som en stellatcell normalt gör i en frisk lever, hos både vuxna individer och foster (Figur 5A). Våra resultat tyder på att denna funktion bla är att styra organisationen och tillväxten av levern, åtminstone under fosterutvecklingen, men det är nog troligt att stellatceller har liknande funktion även i vuxna individers levrar.
Om Lhx2-genen nedregleras startas hela den process som kan leda till levercirros (Figur 5B). Nedregleringen av Lhx2 verkar därför vara den gemensamma molekylära mekanism som sätts igång oavsett om den bakomliggande orsaken till leverskada är alkoholmissbruk, kronisk virushepatit, gallgångssjukdom eller icke-alkoholorsakad steatos. Om man tar bort Lhx2 »kortsluter« man alltså hela processen specifikt i stellatceller, eftersom den startas utan bakomliggande sjukdom eller via andra celler såsom Kupfferceller.
Genom att använda en stellatcellslinje från människa kunde vi visa att aktiverade stellatceller kan återgå till att bli vilande stellatceller om Lhx2-genen slås på (Figur 5C).
Det sistnämnda är speciellt tilltalande, eftersom det skulle betyda att cirrosprocessen skulle kunna vändas, eller åtminstone lindras, om man kunde slå på Lhx2 i en aktiverad stellatcell i en cirrotisk lever.
Även om dessa initiala försök i möss och humana cellinjer ser mycket lovande ut återstår en hel del forskning i både djurmodeller och patientmaterial innan ett läkemedel kan utvecklas. Men vi har åtminstone identifierat en molekylär process som verkar vara central för sjukdomsförloppet vid utveckling av levercirros oavsett vad som orsakat sjukdomen.
Eftersom risken för att utveckla cirros kan vara genetiskt betingad, är det även av stort intresse att en utslagen Lhx2-gen hos möss ger leverfibrosutveckling med 100 procents penetrans [12]. Denna genetiska koppling till fibros-/cirrosutveckling skulle delvis kunna förklara den varierande förekomsten av cirros vid olika leversjukdomar.
*
Potentiella bindningar eller jävsförhållanden: Inga uppgivna.
*
Forskning har stötts av Cancerfonden, Västerbottens landsting och Tobiasstiftelsen.

Figur 1. Histologisk gradering av leverfibros; stadium 4 innebär cirros.

Figur 2. Schematisk bild av en del av en leverlobulus, den minsta organisatoriska enheten i levern, och vilka typer av celler den består av. Stellatcellerna (i blått) är lokaliserade i Disses spatium, som finns mellan hepatocyterna och endotelcellerna i sinusoiderna. Blod som kommer från tarmen filtreras i levern genom att ledas från portavenen (v portae) via sinusoider till centralvenen. I sinusoiderna finns sk Kupfferceller. Galla bildas av hepatocyterna och leds i motsatt riktning i gall-canaliculi till gallgångarna. Gallgången, portavenen och grenen av a hepatica bildar tillsammans en portatriad (eller portazon) där en leverlobulus består av sex portatriader som omger en centralven i ett hexagonmönster. Observera att alla strukturer inte är skalenligt återgivna. (Bilden är modifierad från »Friedman S, Arthur M. Reversing hepatic fibrosis. Sci Med. 2002;8:194-205« [8].)

Figur 3. Summering av de vanliga förändringarna som en stellatcell genomgår när den blir aktiverad under en sjukdomsprocess som leder till levercirros, oavsett orsak. (ECM = extracellulär matrix; ASMA = alfa-smooth muscle actin.)

Figur 4. A. Möss som har genen Lhx2 muterad genomgår samma förändringar som sker i det sjukdomsförlopp som orsakar levercirros hos människa. Det är här illustrerat av den progressiva förhöjningen av ECM-proteinet kollagen typ III, som ses som svarta trådar i levern under fosterutvecklingen hos muterade möss (pilar) (ECM = extracellulär matrix). 4B. Uttryck av Lhx2 i en human stellatcellslinje minskar signifikant uttrycket av de gener som är kopplade till levercirrosutveckling: i detta fall aktiveringsmarkören ASMA (alfa-smooth muscle actin) och ECM-proteinet kollagen typ I. De blå staplarna visar (relativt) genuttryck i stellatceller som uttrycker Lhx2, och de röda staplarna visar genuttryck i stellatceller som inte uttrycker Lhx2.

Figur 5. Summering av vilken roll Lhx2 har i kontroll av aktivering av stellatceller. A. Så länge Lhx2-genen är påslagen kan inte stellatcellen bli aktiverad, och då kan den därmed inte starta processen som leder till levercirros. B. När Lhx2-genen slås av aktiveras stellatcellen, och hela processen som leder till levercirros kan startas. C. Försöken med den humana stellatcellslinjen tyder på att en aktiverad stellatcell kan helt eller delvis återgå till en vilande stellatcell om den börjar uttrycka Lhx2.