Bioaktiva isoprostaner

Oxidativa skador orsakade av fria radikaler har sedan flera årtionden föreslagits vara bidragande patogenetiska faktorer vid åldrande och även arterioskleros. Det har tidigare varit svårt att objektivt mäta oxidativ stress in vivo och därmed också svårt att driva forskningen inom området framåt.
Flera epidemiologiska studier har visat att ett lågt intag av antioxidanten vitamin E kan vara en riskfaktor för kardiovaskulär sjukdom. De placebokontrollerade studier som undersökt om tillskott av vitamin E kan minska risken för kardiovaskulär sjukdom har emellertid inte kunnat verifiera samma samband. Relevansen av oxidativ stress och betydelsen av antioxidanter vid aterogenes har ifrågasats.
Den här översiktsartikeln presenterar isoprostaner som nya och tillförlitliga markörer för mätning av oxidativ stress in vivo. Vidare presenteras isoprostaner som nya användbara verktyg för att belysa det komplexa området antioxidanter och inflammation vid kliniska sjukdomar, liksom vid bedömning av fysiologiska radikalreaktioner. Isoprostaner kan ses i ökad mängd vid flera sjukdomstillstånd associerade med oxidativ stress och inflammation. Nyligen presenterade studier av effekten av vitamin E på isoprostaner har lett till att diskussionerna om vitaminer och kardiovaskulär sjukdom fått ny aktualitet.

Oxidativ stress ett tillstånd av obalans
Oxidativ stress tros vara en bidragande faktor vid flera akuta och kroniska sjukdomar och är sannolikt också inblandad i cellernas åldrande. Oxidativ stress är ett tillstånd av obalans som uppkommer när kroppens produktion av prooxidanter blir för stor i förhållande till kroppens skyddande antioxidativa försvar (Fakta 1).
Många prooxidanter är fria radikaler, till exempel väteperoxider, superoxidradikaler, hydroxylradikaler, peroxylradikaler, kväveoxidradikaler, singlettsyre och ozon. Cellskador och aktivering av fagocyterande celler vid kronisk inflammation kan ligga bakom den ökade bildningen av fria radikaler. Fria radikaler kan också bildas efter exponering för olika toxiner, pesticider, vissa läkemedel, miljögifter och strålning. Om prooxidanter anhopas finns det en risk för att biologiskt viktiga lipider, proteiner och kolhydrater skadas.
Lipider i kroppen eller i maten som påverkas av prooxidanter riskerar att oxideras (härskna). Typiska exempel på oxidation utanför människokroppen är att tavlor bleknar och att bilar rostar med tidens gång. Samma sak sker således i människokroppen och kan ha stora konsekvenser för åldrandet och vid olika sjukdomstillstånd där cell-, vävnads- och DNA-skador förekommer. Skador i DNA kan dessutom orsaka mutationer och leda till uttryck av felaktiga proteiner.


Nödvändig del av fysiologiska reaktioner
Reaktioner med fria radikaler och av dessa produkter är inte enbart av ondo. De är en nödvändig del av olika fysiologiska funktioner som cellsignalering, celldelning och apoptos, kontroll av cellulär homeostas, försvar mot mikroorganismer och reglering av epigenetiska förändringar [1]. Hur detta styrs är ännu okänt. Även om det finns goda teoretiska grunder för att fria radikaler är av betydelse fysiologiskt och vid olika sjukdomstillstånd har det tidigare varit svårt att objektivt påvisa de fria radikalernas roll.
På senare tid har en rad metoder utvecklats för att mäta fria radikaler i provrör vid experimentella försök. Dessa metoder har emellertid inte visat sig generera några reproducerbara resultat på fria radikalers aktivitet in vivo, det vill säga i olika kroppsvätskor och vävnader hos djur och människa. Svårigheten är att fria radikaler är kortlivade och reaktiva, och deras former är svåra att förutsäga. Dessutom är det svårt att veta exakt i vilket kompartment de fria radikalerna bildas och har sin skadliga effekt. Om man ska kunna mäta oxidativ stress måste man utgå från en biokemiskt stabil slutprodukt eller en biprodukt av fria radikalers reaktion. Det här är anledningar till varför det har varit svårt att påvisa de fria radikalerna och förstå deras roll vid fysiologiska förhållanden och vid olika sjukdomar.

Isoprostaner
Att autooxidation av molekyler förekommer i biologiska system är välkänt. Redan på 1970-talet visade man att autooxiderade prostaglandinliknande föreningar från fettsyror bildades in vitro [2]. Den stora upptäckten, att dessa föreningar även kunde bildas in vivo, skedde inte förrän år 1990. Då upptäckte Morrow et al att arakidonsyra genom radikalmedierad oxidation kan omvandlas till en rad bioaktiva föreningar i kroppen och att de skiljer sig från de bioaktiva föreningar som bildas via enzymmedierad oxidation (till exempel via cyklooxygenas, COX) [3-5].
Föreningarna kallas i dag för isoprostaner, och upptäckten av dem har öppnat ett helt nytt biomedicinskt forskningsfält med möjlighet att indirekt mäta fria radikaler, som länge varit svåra att definiera och kvantifiera. Isoprostaner och prostaglandiner har snarlika kemiska strukturer och kännetecken men skiljs åt av framför allt två utmärkande egenskaper. Bildningen av isoprostaner sker till skillnad från syntes av primära prostaglandiner inte enzymatiskt via cyklooxygenas. Vidare har isoprostaner sidokedjan till cyklopentanringen i ciskonfiguration till skillnad från prostaglandiner, där sidokedjan bildas i transkonfiguration. Isoprostanliknande föreningar (neuroprostaner) kan också bildas in vivo från fiskfettsyrorna eikosapentaensyra [6, 7] och dokosahexaensyra [8].

Syntes och nedbrytning
F2-isoprostaner kan bildas i 64 olika närbesläktade former, se översiktsartikel av Basu för en närmare detaljerad beskrivning [1, 5]. En schematisk bild för syntesen ses i Figur 1. Den huvudsakliga F2-isoprostanen som bildas är 8-iso-prostaglandin F2(alfa) (8-iso-PGF2(alfa)). F2-isoprostaner bildas från arakidonsyra förestrad på fosfolipiderna i cellmembranet och hydrolyseras sedan snabbt till fria isoprostaner intracellulärt. De fria isopro-stanerna degraderas sedan via 15-prostaglandindehydrogenas och delta-13-reduktas huvudsakligen i lunga, lever och njure med en halveringstid på 16 minuter hos människa respektive 4 minuter hos kanin [9, 10]. Även om isoprostaner har en kort halveringstid i plasma finns det fria isoprostaner tillgängliga för bestämning i plasma, urin och andra kroppsvätskor tack vare att de produceras kontinuerligt. Nedbrytningen kan i princip ske i alla vävnader där det finns tillräckligt mycket av de degraderingsenzymer som beskrivits tidigare [9].

Unik markör för att påvisa oxidativ stress in vivo
8-iso-PGF2(alfa) och dess isomerer kan ses i ökad mängd i kroppsvätskor vid flera sjukdomar som anses vara relaterade till oxidativ stress och vid experimentella studier där man framkallat oxidativ stress [1, 11, 12]. En av de klassiska djurexperimentella in vivo-modellerna för oxidativ stress är så kallad koltetraklorid (CCl4)-inducerad oxidativ stress. Hepatotoxiskt CCl4 som administreras oralt till råtta omvandlas omgående till fria triklormetylradikaler (CCl3·) i levern och framkallar oxidativ stress. En kraftigt ökad mängd av esterifierade F2-isoprostaner och fria F2-isoprostaner i plasma och urin kunde påvisas efter att man givit 2,5 mg/kg CCl4 till råttor, och antioxidanten vitamin E i högdos kunde hämma den inducerade F2-isoprostanökningen [13, 14]. I experimentella djurstudier med akut framkallad oxidativ stress där man kan förvänta sig höga nivåer av isoprostaner kan både plasma, urin, likvor och mikrodialysvätska användas för detektion. Vid studier av sjukdomar är bestämning av isoprostaner i urin ett bättre alternativ [4, 12]. Det senaste året har också en ny unik metod beskrivits där en specifik antikropp mot 8-iso-PGF2(alfa) använts för att lokalisera oxidativ skada in situ i vävnader [15].

Analysmetoder för isoprostaner
Det har länge varit en utmaning att mäta radikalreaktioner eller oxidativ stress in vivo. Studier visar att lipidoxidation är en snabbare process än protein-, DNA- eller kolhydratoxidation. De flesta traditionella mätmetoder för lipidoxidation som MDA (malondialdehyd), TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), lipidhydroperoxider, konjugerade diener etcetera har metodologiska brister, särskilt vid in vivo-mätning. Metoderna som nämnts är bättre anpassade för in vitro-studier. Nyligen gjordes en stor internationell genomgång av analysmetoder av National Institutes of Health (NIH) USA där ett flertal excellenta laboratorier i världen deltog. Vid genomgången framhölls bestämning av F2-isoprostaner med gaskromatografi/masspektrometri (GC/MS), radioimmunoanalys (RIA) eller enzymimmunoanalys (EIA) som pålitliga metoder för att påvisa oxidativ stress in vivo [16, 17].
Det finns dock en rad svagheter och fallgropar vid analys av isoprostaner. Eftersom flera prostaglandinliknande föreningar kan bildas vid arakidonsyraoxidation via cyklooxygenas är en bra validering av metoden nödvändig. Det är också viktigt att de biologiska proven förvaras i -70 °C. Hydrolysering av de biologiska proven och kromatografisk separation av isoprostanerna är svåra moment vid analysen. En vanlig måltid har ingen påverkan på isoprostanfrisättningen. Det kan däremot stort intag av vissa antioxidanter, läkemedel, rökning och intensiv fysisk aktivitet ha, vilket bör beaktas vid planering av försök. Det är också viktigt att åtminstone kvalitativt jämföra resultaten mellan metoder som GC
MS, RIA eller EIA och etablerade djurexperimentella modeller. Koltetraklorid (CCl4)-induktion oxidativ stress [13, 14, 16, 17] är en sådan metod. I dag har det introducerats flera kommersiellt tillgängliga metoder för att mäta isoprostaner. Dessa metoder bör utvärderas väl innan intresserade forskare börjar använda dem i sina försök.

Isoprostaners biologiska effekter
Isoprostaner (framför allt 8-iso-PGF2(alfa)) uppvisar biologisk aktivitet; dels är de kärlaktiva, dels har de inflammatoriska effekter [12]. 8-iso-PGF2(alfa) har kärlkontraherande effekter i lung- [18-20] och njurartärer [21], i hjärnan [22] och i retina [23] samt aggregerar trombocyter [24]. Isoprostaner påverkar såväl koronarkärl som luftvägar och har visat sig bidra till ateroskleros-utveckling i musmodeller [25]. Ingen specifik receptor har ännu tillskrivits F2-isoprostanerna, utan de biologiska effekterna antas medieras via aktivering av tromboxan A2- eller TP-receptorer/prostaglandin H2-receptorer. Vidare har det visats att 8-iso-PGF2(alfa) vid intravenös injektion framkallar inflammation genom att frisätta proinflammatoriska prostaglandin F2(alfa) (PGF2(alfa)) hos kanin [26].
PGF2(alfa) är en viktig inflammatorisk markör och mediator i såväl fysiologiska som patofysiologiska sammanhang [27]. Både F2-isoprostaner och PGF2(alfa) ökar i nivå vid inducerad leverskada, sepsis, ischemi och reperfusion vid hjärtstillestånd, hjärnskada och ryggmärgsskada i djurexperimentella modeller [13, 28-30]. Tillgång till bra och enkel mätmetodik för isoprostaner kommer att visa att endogena isoprostaner är viktiga mediatorer in vivo liksom även andra prostaglandiner.

Isoprostaner hos friska och vid sjukdom

Friska personer
Oxidativa processer och fria radikaler i lagom mängd och på rätt plats (exempelvis elektrontransportkedjan, immunförsvaret, cellsignalering) är en förutsättning för att upprätthålla kroppens normala fysiologiska funktioner. Dessutom finns en kontinuerlig påverkan av yttre faktorer som bidrar till radikalproduktionen hos människan; till exempel UV-strålning, bakgrundsstrålning från berggrunden, tobaksrök och luftföroreningar. Då vi ständigt utsätts för inre och yttre oxidativ stress (radikalpåverkan) kan isoprostaner uppmätas hos alla människor. Hos friska personer är nivåerna dock relativt låga jämfört med nivåerna vid vissa sjukdomar. En kortfattad sammanställning av isoprostaner vid olika sjukdomar finns i Tabell I.

Fett i maten och isoprostaner
Fettkvaliteten i maten kan vara av betydelse för aterosklerosutvecklingen, och omättade respektive fleromättade fettsyror anses generellt mer gynnsamma för hjärta och kärl än mättade fettsyror. Av de fleromättade fetterna anses det hälsosamt att sträva efter en god jämvikt mellan n-6- och n-3-fettsyror. Koststudier pekar på att nivåerna av isoprostaner i blodet ökar då man byter ut det mättade fettet i kosten mot n-6-fleromättat fett (linolsyra) [31]. Däremot har koststudier inte kunnat visa någon ökning av isoprostannivåer då man byter ut mättat fett i kosten mot en kost som är rik på n-3-fleromättat fett (linolensyra) [32]. De samband som observerats ger stöd för att en lägre n-6-/n-3-kvot är mer gynnsam även med hänsyn till oxidativ stress. Intag av olika transfettsyror (vaccensyra och konjugerad linolsyra [CLA]) har i flera studier visat sig leda till relativt kraftigt ökade nivåer av isoprostaner [33, 34], men orsakerna är inte helt klarlagda. Hälsovinsterna med fisk har åter aktualiserats, och inom det kardiovaskulära området har både den arytmireducerande och den blodfettsänkande egenskapen hos fiskfettsyror framhållits. Kosttillskott med fiskfettsyror (dokosahexaensyra och eikosapentaensyra) hos både friska och i olika patientgrupper har entydigt visat sig leda till en sänkning av isoprostannivåer [11, 35].

Kardiovaskulära sjukdomar och riskfaktorer
Fria radikalers skador på lätta lipoproteiner, low density lipoproteins, (LDL-kolesterol), är en av flera föreslagna parallella mekanismer vid aterogenes och kardiovaskulära sjukdomar. Isoprostanerna ger en ny möjlighet att studera dessa teorier med en biologiskt aktiv markör. Studier har funnit isoprostaner i ökad mängd i skumceller i aterosklerotiska plack i humana koronarkärl [36]. Detta fynd ger ökat stöd till teorierna att skumceller i kärlväggen tar upp oxiderade fetter som en del av patogenesen bakom ateroskleros och kan också tala för att isoprostanerna dessutom har en direkt roll som mediator vid ateroskleros.
In vitro-studier har visat att isoprostaner är vasokonstrik-tiva, aggregerar trombocyter och ökar granulocytaggregationen mot kärlväggen, faktorer som bidrar till patofysiologin vid aterogenes [37]. Att kvantifiera isoprostaner hos patienter med aterosklerossjukdom innebär en del metodologiska problem. Det faktum att hjärt- och kärlsjuka i högre grad medicinerar med acetylsalicylsyra (ASA) och statiner, vilka har potential att sänka isoprostanivåerna [38], har försvårat studier eftersom positiva samband riskerar att maskeras. Trots det har en forskargrupp nyligen visat att patienter med stenoser i ett eller flera kärl som verifierats med koronarangiografi hade förhöjda nivåer av isoprostaner jämfört med patienter som inte hade stenoser [39].
Teoretiskt bör isoprostanbildning inte påverkas direkt av ASA eftersom isoprostaner bildas via fria radikaler. Isoprostannivåerna sänks troligen sekundärt av ASA via hämning av cyklooxygenasmedierade PGF2(alfa) [38]. Det finns en stark korrelation mellan frisättning av isoprostaner och PGF2(alfa) [26, 40, 41]. Isoprostaner ökar också vid hjärtsvikt och kan aktivera tromboxanreceptorer (TP) med TXA2-liknande effekter. Tromboxan kan sannolikt aktiveras i endotel [42, 43]. Troligen ökar trombocytaggregering vid hjärtinfarkten, men det är inte studerat om lågdos-ASA hämmar isoprostanbildning vid hjärtsvikt.
Flera sjukdomar och sjukdomstillstånd som är förenade med ökad risk för aterosklerosutveckling är också associerade med ökade isoprostannivåer. Aktiva rökare, personer som varit rökare och även barn till rökare har högre nivåer av isoprostaner än icke-rökare [40, 44, 45] (Figur 2). Det faktum att isoprostaner har setts minska vid rökstopp kan tyda på en trolig akut radikaleffekt inducerad av de många toxiska ämnena i cigarettröken.
Sammanfattningsvis verkar de klassiska, metabola, kardio-vaskulära riskfaktorerna med undantag för hypertoni vara associerade med isoprostaner i ökad mängd. Det tyder på att de kardiovaskulära riskfaktorerna är relaterade till oxidativ stress och att denna i sig kan utgöra en patogenetisk grund för aterosklerosutveckling. Den nya möjligheten att mäta isoprostaner in vivo vid olika sjukdomstillstånd talar för tidigare teoretiska resonemang om fria radikalers skadliga roll och adderar kunskap om varför dessa tillstånd är riskfaktorer för kardiovaskulär sjukdom.

Lungsjukdomar
Flera lungsjukdomar har misstänkts ha samband med oxidativ stress. Isoprostaner har hittats i ökad mängd i både utandningsluft och plasma hos patienter med astma, akut respiratoriskt stressyndrom, cystisk fibros, pulmonell hypertension och kroniskt obstruktiv lungsjukdom [5]. Vid vissa av sjukdomarna kan isoprostaner även ha en direkt patogenetisk roll på grund av att de utövar biologisk aktivitet i form av bronkkonstriktion, vasokonstriktion, induktion av förändringar i vaskulaturens permeabilitet och interaktion med inflammatoriska celler [46].

Ålder, kön, etnicitet
Hypotesen att oxidativ stress medverkar till åldrandet har lett till att sambanden mellan ålder och isoprostaner studerats i stor omfattning. Studierna pekar dock åt olika håll, och inget klart samband har kunnat uttydas. I studierna redovisas både positiva och negativa korrelationer, såväl som inga korrelationer alls, mellan isoprostaner och ålder. Resultaten verkar vara avhängiga av vilken åldersgrupp som studeras och även av etniska och sociala faktorer [11, 47-49]. Effekten av kön och etnicitet på nivåer av isoprostaner är inte heller helt klarlagd. Det finns en svag övervikt av studier som antyder att kvinnor generellt har något ökade nivåer jämfört med män och att vita har något ökade nivåer jämfört med afrikanska amerikaner [11, 47, 49]. I kliniska studier av isoprostaner bör man dock tills vidare beakta ålder, kön och etnicitet som potentiella interagerande faktorer.

Vitaminer och isoprostaner
Varken (alfa)-tokoferol (här benämnt vitamin E) eller vitamin C som kosttillskott har visat mätbara effekter på isoprostannivåer hos friska människor [50, 51]. Vitamin E gavs dock som kosttillskott under en relativt kort tidsperiod, endast åtta veckor, vilket gör den studien svår att värdera. Nyligen har det föreslagits att endast höga doser vitamin E (1 600 eller 3 200 IE) som ges under en period av minst 16 veckor behövs för att påverka isoprostannivåerna [52]. Flera studier har verifierat att tillskott av vitamin E kan sänka isoprostannivåerna hos patienter med sjukdomstillstånd som medför högre risk för kardiovaskulär sjukdom, som typ 2-diabetes och hyperkolesterolemi [53, 54]. Vitamin C som kosttillskott sänkte isoprostannivåerna hos rökare [55]. Kombinationen av vitamin E och C som kosttillskott har i de relativt låga doser som givits inte visat några isoprostansänkande effekter hos friska eller hos sjuka [54, 56].

Vitamin E och kardiovaskulär sjukdom
Ett flertal omfattande epidemiologiska populationsstudier har visat att intag av vitamin E via mat och som kosttillskott är relaterat till en lägre risk för kardiovaskulära sjukdomar [57, 58]. Hypotesen är att oxidativ stress bidrar till aterogenesen och att antioxidanten vitamin E kan hämma det förloppet. De flesta större randomiserade, placebokontrollerade interventionsstudier som gjorts med vitamin E de senaste åren har dock inte kunnat visa någon minskad risk för att insjukna i hjärt- och kärlsjukdomar [58-61] eller minskad mortalitet [62]. Det är ännu inte klarlagt vad denna skillnad beror på.
Sannolikt är sambandet mellan oxidativ stress och antioxidanter mer komplext än vad man väntade sig. Trots att grundtanken i studierna var att kunna sänka nivån av oxidativ stress med tillskott av vitamin E saknas utvärdering av försöksdeltagarnas status av oxidativ stress både vid baslinjen och vid avslutad studie. Troligtvis är anledningen att möjligheten till tillförlitlig mätning av oxidativ stress in vivo tidigare varit begränsad. Genom att mäta nivåer av isoprostaner är det nu möjligt att utvärdera oxidativ stress hos studiedeltagare före studien, under studiens gång och efter avslutad behandling.
En annan viktig synpunkt är att det saknats kunskap om vilken dos eller vilken form av vitamin E som ska användas för att effektivt motverka oxidativ stress och reducera risken för kardiovaskulär sjuklighet. I studierna har man använt vitamin E i doser på 100–400 IE/dygn och upp till 800 IE/dygn i enstaka studier [59]. Även här kan man nu ta hjälp av isoprostanerna för vägledning. Genom att mäta isoprostaner efter olika doser av vitamin E-tillskott hos patienter med höga blodfetter har det konstaterats att vitamin E först i doser om 1 600 IE eller 3200 IE/dygn mätbart kan minska oxidativ stress [52].
Sammanfattningsvis är det ännu svårt att värdera vitaminernas roll som hämmare av oxidativ stress och som skyddande faktor vid utveckling av kardiovaskulär sjukdom. Mätning av isoprostaner utgör en möjlighet att driva forskningen framåt inom det här området och kan vara ett verktyg vid utvecklingen av nya antioxidativa läkemedel mot oxidativ stress.
*
Potentiella bindningar eller jävsförhållanden: Inga uppgivna.

Figur 1. En schematisk bild av isoprostanbildning från arakidonsyra.ROS = Reactive oxygen species.

Figur 2. Medelvärdet av isoprostaner i urin (±SD) hos icke-rökare (209), tidigare rökare (437) och aktiva rökare (49) bland 77-åriga män ur kohorten ULSAM (Uppsala Longitudinal Study of Adult Men).