Under sommaren 2006 uppmärksammades ett antal fall av sårinfektioner som drabbade badare i svenska och danska vatten. I Sverige kom denna infektion att kallas »badsårsfeber«, en sårinfektion som orsakas av bakterier tillhörande släktet Vibrio [1, 2]. Vibrio kopplas oftast samman med diarrésjukdomar, som vanligen smittar via skaldjur eller dricksvatten, men det har visat sig att de också kan leda till andra mer eller mindre allvarliga infektioner. Sjukdomsförloppen hos olika åldersgrupper skiljer sig markant åt. I de yngre åldrarna handlar det framför allt om ögoninfektioner och externa otiter, medan den äldre patientgruppen får sårinfektioner, ibland med sepsis som följd. Patienter som drabbas värst av dessa infektioner är generellt i dålig kondition med nedsatt immunförsvar eller leversjukdom. Till den senare gruppen hörde patienten som avled 2006. Vibrio-infektioner, förutom tarminfektioner, behandlas vanligen med doxycyklin eller ceftazidim, men även kinoloner kan användas.
Det första väldokumenterade fallet av en Vibrio-relaterad sårinfektion inträffade i slutet av 1980-talet [3], och 2004 drabbades bla en kvinna av en allvarlig infektion efter att ha badat i ett träbadkar med uppvärmt (38 °C) vatten från Östersjön. Den bakterie som isolerades bestämdes till en icke-agglutinerande och icke-toxinproducerande V cholerae. Skåne och Blekinge hade elva fall av badsårsfeber under sommaren 2006. Totalt insjuknade 41 personer i Sverige, varav 23 troligen smittades inom Sverige [2]. Detta var en betydande ökning mot året innan, då totalt 25 personer insjuknade. Sommaren 2007, som var betydligt kallare, insjuknade 22 personer, varav endast två i Skåne/Blekinge. I dag råder Smittskyddsinstitutet speciellt äldre personer med sår att undvika bad utomhus då vattentemperaturen överstiger 20 °C i mer än en vecka.


Vibrios taxonomi och naturliga habitat
Vibrio är gramnegativa, oftast rörliga, 1 (my)m (gånger) 2–3 (my)m långa stavar. De flesta är uteslutande marina, men vissa viktiga arter kan klara sig utmärkt vid låga salthalter eller i sötvatten. Bland de senare finns V cholerae, med ett salthaltsoptimum på 0,4–1,7 procent. Humanpatogena Vibrio-arter växer generellt dåligt vid temperaturer under 17 °C och dör snabbt vid temperaturer över 45 °C. Taxonomiskt tillhör Vibrio gammaproteobakterierna [4], och de tillhör den normala bakteriefloran i akvatiska system. Man hittar dem som frilevande i vattenmassan, fastsittande på partiklar, som tex levande eller döda alger, och som associerade till fisk och skaldjur. Vibrio är viktiga nedbrytare av organiskt material och har betydande exoenzymaktiviteter, tex i form av kitinaser som behövs för nedbrytning av små kräftdjur (zooplankton). Det finns Vibrio-arter som är patogena för såväl människa som marint levande djur. Ett exempel är fiskpatogenen V anguillarum, som kan orsaka problem för fiskodlare. Motsatsen finns också: Vibrio-arter som lever i symbios med tex musslor eller bläckfisk [5].


Vibrio cholerae och andra humanpatogena Vibrio
Epidemiska stammar av V cholerae är starkt kopplade till förekomsten av koleratoxin och koleratoxinrelaterade pili. Genen som kodar för koleratoxinet ligger i en bakteriofag (bakterievirus) och kan därför spridas mellan olika stammar. Toxinrelaterade pili är receptor för bakteriofagen och avgörande för spridningen av toxingenen. Vad som är extra intressant är den evolution som skett av V cholerae. Pandemi fem och sex orsakades av serotyp O1, klassisk biotyp. Den sjunde pandemin, som startade 1961, orsakades av serotyp O1, biotyp El Tor. I dag vet man att klassisk och El Tor-biotyp skiljer sig åt genotypiskt [6]. Det kolerautbrott som startade 1992 i Bangladesh och Indien orsakades av serotyp O139. Detta visade för första gången att non-O1-serotyper kunde orsaka pandemisk kolera. Ibland refereras detta utbrott som den åttonde pandemin, men både serotyp O139 och O1 El Tor samexisterar ännu i dag. Non-O1/O139- serotyper av V cholerae kan också orsaka human diarré, men dessa stammar saknar det virulensgenpaket som är associerat med pandemiska kolerastammar. Det är ofta dessa stammar som kan ge extraintestinala infektioner. Non-O1/O139 är vanliga i alla vatten världen över, så även i svenska.
V vulnificus och V parahaemolyticus är förutom V cholerae de viktigaste humanpatogenerna inom släktet Vibrio. Dessa arter kan orsaka varierande grad av infektion hos människa efter exponering via vatten eller föda. Virulensen mellan art och stam varierar betydligt. Den vanligaste arten som isolerats från akvatiska områden världen över är V parahaemolyticus. Den orsakar främst gastrointestinala problem. Bland isolerade fältprov ligger virulensen på ca 2 procent men kan variera signifikant beroende på årstid och geografiskt område [7, 8]. Vanligast är att man infekteras efter konsumtion av kontaminerade skaldjur, som musslor eller ostron. I Sverige har två utbrott förekommit associerade till konsumtion av kinesiska kräftor. I det ena fallet var orsaken förvaring av kokta kräftor i förorenat vatten, i det andra gick den inte att spåra.
V vulnificus anses alltid vara virulent. Arten kan ge allvarliga sårinfektioner med efterföljande sepsis, men ännu svårare infektioner kan drabba dem som fått i sig bakterien via födan. Högriskgruppen utgörs av äldre personer med leversjukdomar, hematologiska sjukdomar eller med generellt nedsatt immunförsvar. Hos denna patientgrupp är mortaliteten hög, ca 50 procent. Vanligaste smittkälla är även i detta fall skaldjur.
Andra Vibrio-arter som V mimicus och V fluvialis kan orsaka gasteroenterit och har bla noterats som orsak till barndiarré. V alginolyticus, Grimontia (Vibrio) hollisae mfl är alltid lågvirulenta men kan hos mottagliga personer sporadiskt orsaka gastrointestinala eller extraintestinala infektioner. Speciellt vanligt är externa otiter. Photobacterium (Vibrio) damsela är i stor utsträckning lik V vulnificus och orsakar enbart infektioner i sår efter bad i bräckt vatten eller vid skada orsakad av djur i saltvatten. Infektioner är ovanliga, men hos de drabbade är dödligheten 25 procent.


Vibrio och algblomning
Distributionen av Vibrio i tid och rum är dynamisk och beroende av en mängd direkta och indirekta faktorer. Parametrar som temperatur, salthalt, närsalter och planktonbiomassa har upprepade gånger rapporterats som viktiga och kan ibland användas som varningssystem för koleraepidemier [9]. Detta tyder på att födovävarna i vattensystemen spelar en viktig roll för smittspridningen. I ett framtidsscenario med ökad global uppvärmning kommer troligen Vibrio-relaterade problem att öka [9, 10]. Detta beror på att högre temperatur medför mer nederbörd, som i sin tur ökar avrinningen från land. Med vattnet förs näringsämnen som gynnar Vibrio-tillväxt direkt men också indirekt genom ökad frekvens av algblomningar.
Det är okänt hur naturligt förekommande, lågvirulenta Vibrio förändras till virulenta och epidemiorsakande stammar. Inte heller vet vi hur virulenta Vibrio anpassar sig när de återgår till sin naturliga vattenmiljö. Sekvensanalys av hela genom från olika Vibrio-arter har visat att patogena stammar innehåller sk patogena öar (PAI) [11]. Liknande ansamlingar av gener i lågpatogena stammar kallas »fitness-öar« eller ekologiska öar. Alla dessa »genpaketsöar« antas kunna transporteras mellan olika Vibrio-stammar. Starka selektionskrafter driver på denna mikroevolution, eftersom Vibrio konstant måste anpassa sig till olika omvärldsförhållanden för att överleva och konkurrera framgångsrikt med andra organismer i vattenmassan. För att få inblick i denna mikroevolution måste man veta vad som händer med Vibrio i naturliga vattensystem.


Studiens syfte
Vi studerar därför hur Vibrio interagerar med andra mikroorganismer och hur kliniska isolat acklimatiserar sig när de återkommer till vattensystemet. Genom dessa studier har vi tex indikationer på att Vibrio gynnas av vissa alger men missgynnas av andra i ett marint system [12]. Andra försök som pågår inkluderar analys av överlevnaden av kliniska isolat i vatten vid olika temperatur och i naturliga sediment vid vintertemperaturer.
Sommaren–hösten 2006 genomförde vi ett provtagningsprogram för att påvisa patogena Vibrio-arter i vatten vid den skånska västkusten. Vi valde att analysera förekomst av Vibrio i vatten via blåmusslor, då musslor fungerar som naturliga biofilter och därför ger en integrerad bild av förekomsten vid varje provtagningstillfälle. DNA extraherat från musselhomogenat analyserades med avseende på innehåll av gener specifika för V cholerae, V parahaemolyticus och V vulnificus med hjälp av PCR-teknik. Strax efter starten av provtagningsprogrammet rapporterades de första fallen av non-O1/O139-V cholerae- associerade sårinfektioner från Karlskrona i Blekinge.


Material och metod
I Öresund utgörs ytvattnet av brackvatten från Östersjön, och djupare finns en sydgående ström av saltare vatten från Kattegatt. På grund av strömmarna med vatten av olika ursprung varierar salthalten, och under perioden juni–september 2006 låg den mellan 9,1 och 17,4 practical salinity units (PSU), med ett medelvärde på 12,6. Medeltemperaturen i vattnet var 22,5 °C i juli, med en toppnotering på 24,1 °C den 25 juni i Råå. I augusti var medeltemperaturen 20,5 °C och sjönk sedan ytterligare till 15,6 °C vid provtagning i september. Blåmusslor (Mytilus edulis) samlades in vid två lokaler, Domsten (56°06´58ÓN 12°36´ 12ÓE) 11 kilometer norr om Helsingborg och Råå (55°59´31ÓN 12°44´30ÓE) 7 kilometer söder om Helsingborg. Vid Domsten plockades musslor vid vattenbrynet, medan musslorna från Råå plockades en bit ut från stranden på ett djup av ca 0,5 m.


Preparation av musslor och analyser
Insamling av musslor gjordes 17 gånger under sommaren 2006, mellan den 4 juli och 25 september. Minst tolv musslor (medelvikt musselkött per mussla är 1,25 ± 0,8 g) plockades vid varje tillfälle och förvarades kallt fram till dess att analysen påbörjades. Musslorna skrubbades och sköljdes i destillerat vatten. De öppnades sedan aseptiskt, och musselkött tillsammans med eventuell vätska homogeniserades i två minuter i en steril mixer. Från musselhomogenatet odlades Vibrio spp fram enligt anrikningsmetod: preanrikning i alkaliskt peptonvatten (pH 8,0–8,5) och utstryk på Vibrio-specifika TCBS-agarplattor (thiosulfate citrate bile salts sucrose, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) [13]. För kvalitativ undersökning av musslornas innehåll extraherades totalt DNA från musselhomogenat med ett extraktionskit (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen). Kvalitativa analyser av Vibrio-specifika gener gjordes sedan med PCR-teknik (Tabell I).


Resultat
I vårt material kunde vi redan från starten av provtagningen den 4 juli detektera Vibrio-specifika gener och virulensgener (Figur 1). Det sista positiva provet detekterades den 25 augusti, och därefter var alla prov negativa. Vi kunde inte heller isolera Vibrio genom anrikning. Totalt under provtagningsperioden var 61 procent av musselproven positiva för non-O1/O139-V cholerae (toxR). Alla prov var negativa för ctx-genen (koleratoxingenen). 89 procent av musselproven var positiva för V parahaemolyticus (tlh), varav 61 procent var positiva även för virulensgenerna tdh och trh. V vulnificus detekterades i 72 procent av musselproven (vvh och/eller viuB).


Diskussion
Ett kilo blåmusslor kan filtrera upp till 90 liter havsvatten per timme och samlar under filtreringen upp partiklar ned till virusstorlek på sina gälar. Analys av Vibrio-förekomst med hjälp av musslor ger därigenom en integrerad bild av förekomsten av Vibrio i ett vattensystem. Vibrio tillväxer heller inte i musslor så länge vattentemperaturen inte är så hög att musslorna stressas (>25 °C). Vi har valt att använda molekylär identifiering av Vibrio, eftersom dessa bakterier kan förekomma i både odlingsbart och icke-odlingsbart tillstånd (»culturable« eller »viable but non culturable«). Det betyder att odling med eller utan anrikning ger missvisande resultat. Nackdelen med att detektera förekomst av Vibrio via konventionell PCR-teknik är att det svar man får inte är kvantitativt. Därför håller vi på att utveckla och förfina kvantitativa PCR-metoder för detektion av totala antalet av såväl Vibrio som V cholerae, V parahaemolyticus och V vulnificus.
Med kvalitativ PCR-teknik har vi kunnat visa att 89 procent av de musselprov vi analyserat innehöll V parahemolyticus och att 61 procent av dessa bar på en virulensgen. Detta är en vid internationell jämförelse hög siffra [7, 8, 14]. Förklaringen till denna diskrepans är att andra studier alltid analyserat musslor tänkta för konsumtion. Vi har inte använt oss av repodlade musslor som hänger fritt i vattenmassan utan genomgående analyserat musslor insamlade vid strandkanten nära botten, eftersom syftet med vår studie var att följa förekomsten av potentiellt humanpatogena Vibrio-arter i vattenmassan och inte, som är fallet med andra studier, att påvisa att musslor odlade för konsumtion inte innehåller patogena Vibrio-arter.
Studier av isolerade stammar och kliniska isolat pågår, och vi tittar bla på överlevnaden av olika kliniska V cholerae-isolat vid olika salthalter och vattentemperaturer. Preliminära resultat visar att överlevnaden är lika bra för kliniska isolat som för isolat från naturen vid 20 °C och 6 °C. Vi studerar även musslors upptag av kliniska isolat respektive isolat från naturen, och resultaten visar att musslor tenderar att ta upp isolat från naturen i större utsträckning än kliniska isolat. Detta kan tyda på att musslor kan skilja på virulenta och icke-virulenta stammar. Tidigare studier på musslors upptag av Salmonella har klart visat att musslor har förmåga att skilja mellan patogena och icke-patogena bakteriestammar [16].


Konklusion
Ett slående resultat av våra analyser var att vi så enkelt kunde hitta och isolera Vibrio från de sydsvenska vattnen under sommarperioden. Salthalterna i Östersjöregionen är idealiska för framför allt V cholerae och V vulnificus, och med ökad årlig vattentemperatur kan vi troligen räkna med att koncentrationerna av dessa bakteriearter kommer att öka. Ökad avrinning från land innebär ökande övergödning, som i sin tur också gynnar Vibrio. Detta sker både direkt, eftersom Vibrio-tillväxt gynnas av mycket organiskt material i vattenmassan, och indirekt genom att övergödning leder till mer frekventa och kraftigare algblomningar, som i sin tur genererar ökad mängd organiskt material. Badsårsfeber och andra Vibrio-relaterade infektioner är med andra ord här för att stanna.
*
Potentiella bindningar eller jävsförhållanden: Inga uppgivna.
*
Överläkare Johan Rydberg har granskat fakta, personal vid avdelningen för klinisk bakteriologi, Centralsjukhuset, Kristianstad, har utfört biokemiska analyser. Jim Collin, Ellen Jönsson och Nina Linné har hjälpt till med provtagningen.


Om tabellen är svårläst hänvisas till artikelns pdf (se högst upp eller längst ner på denna sida).



Figur 1. Procentuell förekomst av Vibrio spp vid provtagning av musslor sommaren 2006. Artspecifika gener markerade med grönt, virulensgener med blått och negativa prov med gult.