Orsaken till preeklampsi på väg att klarläggas

Havandeskapsförgiftning, preeklampsi, drabbar varje år 3–7 procent av alla gravida kvinnor. Globalt uppskattas omkring 8 500 000 blivande mödrar i världen drabbas varje år, varav 5 000 i Sverige. Preeklampsi är en av de ledande dödsorsakerna under graviditeten hos både mödrar och foster. I dag finns inga etablerade undersökningar eller laboratorieprov som på ett tidigt stadium kan identifiera de kvinnor som löper ökad risk för att utveckla preeklampsi.
Sjukdomen definieras som hypertoni och proteinuri som debuterar efter 20:e graviditetsveckan. Symtomen är diffusa, vilket gör den kliniska bilden svårbedömd. I dag finns endast symtomatisk blodtrycksbehandling, och den enda kurativa åtgärden är att avbryta graviditeten genom att förlösa modern. Optimal tidpunkt för förlossning bestäms genom att beakta både barnets och moderns välmående [1].
Preeklampsi orsakar 15 procent av alla prematura födslar och leder dessutom till intrauterin tillväxthämning i ca 25 procent av fallen. Sammantaget bidrar pre­eklampsi till stort lidande och hög mortalitet för såväl mor som barn. De årliga vårdkostnaderna för sjukdomen har globalt uppskattats till 30 miljarder dollar.

Tvåstegsmodellen ger generellt vedertagen förklaring
Preeklampsi kallas teoriernas sjukdom, eftersom ett flertal olika hypoteser och teorier har förts fram genom åren. Det faktum att bortförskaffande av moderkakan, placentan, är nödvändigt för att symtomen ska gå i regress, har lett till den i dag förhärskande teorin att placentan är orsak till uppkoms­ten av preeklampsi [1]. Tvåstegsmodellen är den förklaringsmodell som i dag är generellt vedertagen [2, 3].

Steg 1 börjar med en defekt placentabildning kännetecknad av ytlig inväxt av placentans celler, trofoblasterna, i deciduan i livmoderslemhinnan och ofullständig omvandling av spiralartärerna [4]. Detta leder till försämrad genomblödning av placentan och till ojämn syrgas­transport, vilket i sin tur bidrar till bildning av ischemi/reperfusionsskador och bildning av fria syrgasradikaler.
Höga nivåer av fria syrgasradikaler ger oxidativ stress och kan skada placentans struktur och funktion. Oxidativ stress (Fakta 1) kan definieras som en obalans mellan uppkomsten av oxidativa substanser och det kroppsegna försvarssystemet mot oöns­kad oxidation. Oxidanterna är ofta fria syrgasradikaler som normalt bildas i små mängder, bl a i mitokondriernas andningskedja, men som bildas i högre grad vid ischemi/reperfusion. Dessa oxidanter är starkt reaktiva och kan orsaka strukturella och funktionella skador på cellens DNA, proteiner och cellmembran [5, 6].
Placentans och blodkärlens celler utgör blod–placentabarriären, som effektivt skiljer den fetala och maternella cirkulationen. Transport av gaser och näringsämnen över barriären sker normalt mycket välreglerat, men vid barriärskador uppstår ett ospecifikt läckage mellan de båda cirkulationerna. Oxidativ stress och vävnadsskada leder till att en eller flera faktorer frigörs från placentan och läcker över till den maternella cirkulationen.

I steg 2 ger detta läckage av foster- och placentaderiverat material upphov till en maternell endotelskada och systemisk inflammation [5, 7, 8]. Sådana läckande faktorer, som alltså binder samman steg 1 med steg 2, benämns traditionellt som faktor X, syftande på att »X:et« ännu är oidentifierat.
De klassiska kliniska manifestationerna vid preeklampsi, hypertoni, ödem och proteinuri [9], bottnar i en endotelskada [7, 10]. Ett dysfunktionellt blodkärlsendotel resulterar i ökad vasokonstriktion, ödem, proteinuri och högt blodtryck. Cirkulerande endotelceller har påvisats som tecken på vaskulär skada [11]. Obalans mellan vasokonstringerande och vasodilaterande faktorer har beskrivits. Endotelderiverade faktorer såsom endotelin, angiotensin II och tromboxan har visats vara förhöjda och prostacyklin och kväveoxid (NO) sänkta. Nettoeffekten av dessa förändringar blir ökad vasokonstriktion och hypertension [12-14].
Endotelskadan triggar även en aktivering av koagulationssystemet. Ökad trombocytaktivitet ses vid preeklampsi, vilket i svåra fall kan leda till disseminerande intravasal koagulation (DIC) [15]. Trombos i placentans kärl försämrar perfusionen ytterligare, vilket leder till en negativ sjukdomsspiral. Till detta kan läggas att de läckande foster- och placentafaktorerna oftast är kroppsfrämmande för mammans immunförsvar, varför en inflammation induceras som också bidrar till en generell endotelskada.
Eftersom inte alla gravida kvinnor med dysfunktionell placenta utvecklar preeklampsi, har tvåstegsmodellen modifierats med avseende på steg två [3]. Konstitutionella faktorer hos modern gör henne mer eller mindre benägen att reagera på de utsöndrade placentafaktorerna. Endotelskada är en gemensam konvergenspunkt för de flesta fallen, varför kvinnor med systemsjukdomar med endotelskada är predisponerade för att utveckla preeklampsi.

Sökandet efter faktor X
Faktor X, länken mellan steg 1 och steg 2 i utvecklingen av preeklampsi, är något av en helig graal inom preeklampsiforskningen. I likhet med legenden är den, trots intensiv forskning, ännu inte funnen. Modern molekylärbiologi har under de senaste tio åren bidragit till att man med hjälp av gen- och proteinprofileringsstudier har kunnat isolera ett flertal faktorer som i dag studeras. Komponenter från den skadade placentan och fostret har påvisats i den maternella cirkulationen: fritt fetalt DNA [16-18], fragment av syncytiotrofoblasternas basalmembran (STMB) [19] och mikropartiklar [20] är några av de faktorer som studeras.

Ökad expression av fetalt Hb i placenta vid preeklampsi
Vårt eget sökande efter faktor X inleddes med jämförande undersökning av gen- och proteinuttrycket i placentor från patienter med preeklampsi och normalgravida med hjälp av mikromatris- (microarray-) och proteomikteknik. Mikro­matris­teknik jämför genuttryck i två populationer, och gener som är uppreglerade (starkare signal) respektive nedreglerade (svagare signal) identifieras i respektive grupp.
För att minimera bakgrundsbruset av gener med oförändrad signalstyrka skapade vi ett subtraktionsbibliotek. Då gener som uttrycks i friska placentor subtraherades bort från gener som uttrycks i preeklampsiplacentor återstod endast de gener som skilde de två grupperna åt. Totalt isolerades och identifierades 750 preeklampsiassocierade gener, vilka användes för tillverkning av analyschip till mikromatris [21]. Vid analys av preeklampsiplacentor med dessa chip kunde vi påvisa en generell ökad expression av gener involverade i inflammation, apoptos och oxidativ stress.
Mer specifikt såg vi ökad expression av fetalt hemoglobin (HbF) (Fakta 2) i form av förhöjda mRNA- och proteinnivåer. För att lokalisera cellerna som bildar HbF i placentan användes in situ-hybridisering och immunhistokemi. Cellerna identifierades som hematopoetiska stamceller lokaliserade till kärllumen (Figur 1).

Fritt hemoglobin orsakar oxidativ stress
Fritt Hb är hemoglobin som hamnat utanför de röda blodkropparna. Oxi-Hb, dvs Hb med bundet syre, genererar spontant fria syrgasradikaler, t ex superoxidanjoner, varvid det bildas aggregerade och oxiderade former av molekylen, nedbrytningsprodukter, fritt järn (Fe2+) och fria hemgrupper. Hemoglobin och dess nedbrytningsprodukter har toxiska egen­skaper som orsakar oxidativ stress (Fakta 1), hemolys, vasokonstriktion, njur- och kärlendotelskador [22].
Kroppen har ett flertal skyddsmekanismer, som normalt skyddar mot de skadliga effekterna av fritt Hb. Antioxidanter såsom vitamin C och E skyddar mot oxidativ stress. Viktiga bindarproteiner (s k scavenger-proteiner) är haptoglobin och hemopexin som finns i blodplasma, där de binder fritt Hb och fria hemgrupper, varpå de elimineras från blodet genom cellulärt upptag via specifika receptorer på makrofager och i levern [23, 24].
Alfa-1-mikroglobulin (A1M) är ett litet protein som deltar i försvaret mot fritt Hb, som både antioxidant och bindarpro­tein av fria radikaler och hemgrupper [25-27]. Produktionen av A1M sker i kroppens alla organ, dock huvudsakligen i levern, varifrån det utsöndras via blodet till kroppens extracellulärvätska. Syntesen av A1M stimuleras (uppregleras) av fritt Hb och dess nedbrytningsprodukter hem och fria radikaler [28]. Proteinet förhindrar oxidation och oxidativa skador på celler och matrixmolekyler samt avlägsnar hemgrupper från cellmembran och cytosol [27].

Fritt hemoglobin orsakar placentaskador
Då vi hade funnit förhöjt genuttryck av HbF i preeklampsiplacentor och en massiv förekomst av detta protein i lumen i placentakärlen, ställde vi upp hypotesen att HbF deltar i patogenesen av preeklampsi genom att både orsaka placentaläckaget och fungera som faktor X, dvs HbF läcker över till det maternella blodomloppet.
För att utvärdera vilka toxiska effekter fritt HbF har på placentavävnad vid preeklampsi använde vi oss av placentaperfusionsmodellen, ett väldokumenterat ex vivo-system som används för att studera placentafunktion med avseende på näringstransport, omhändertagande av gifter och läkemedel [29]. Modellen kan liknas vid en artificiell livmoder, där en funktionell del av placentan, en kotyledon, hålls levande genom att en näringslösning, som ersätter blod, pumpas runt i placentans blodkärl i två blodomlopp, moderns och fostrets (Figur 2). Modellen efterliknar den gravida in vivo-situationen bättre än placentacellskulturer och djurförsök [31] (Fakta 3).
Fritt HbF tillsattes den fetala cirkulationen. Redan inom 10 minuter uppstod en preeklampsiliknande situation i form av snabb stegring av blodtrycket. Efter ca 1 timme uppstod ett läckage av näringslösning från fostercirkulationen till den maternella cirkulationen, ett tecken på att placentabarriären tagit skada (Figur 3, grafen). Vävnadsskadorna bekräftades med elektronmikroskopi. De placentor som perfunderats med fritt Hb i fostercirkulationen uppvisade stora skador på extracellulärmatrix, och kollagenfilamenten som upprätthåller vävnadsstrukturen försvann nästan helt (Figur 3, till väns­ter och i mitten). Vidare sågs utbredda cellulära förändringar med skador på membran, kärnor och mitokondrier samt bildning av apoptotiska blåsor och vakuoler. Placentor perfunderade med fritt Hb upp­visade, förutom samma strukturella skador som vid pre­eklampsi, även motsvarande genprofil.
Sammantaget talar dessa ex vivo-fynd för att fritt Hb spelar en viktig roll i sjukdomsetiologin [30, 33].

A1M motverkar placentaskador orsakade av fritt Hb
För att evaluera den potentiella behandlingseffekten av A1M perfunderades placentorna med fritt Hb i den fetala cirkulationen (som tidigare beskrivits) samtidigt som A1M tillsattes den maternella cirkulationen. Syftet var att simulera en potentiell framtida intravenös behandling. Effekterna av A1M var tydliga: Hb-läckaget från den fetala till den maternella cirkulationen upphörde helt (Figur 3, grafen), och de strukturella skadorna kunde inte påvisas efter A1M-behandling (Figur 3, längst ner till höger).
Behandling med A1M ledde även till uppreglering av gener som kodar för de strukturella komponenterna i extracellulärmatrix, vilket indikerar att en läkningsprocess initierats av A1M.

Fritt HbF och A1M – prediktiva och diagnostiska biomarkörer
Eftersom fritt HbF läcker över till den maternella cirkulationen och A1M naturligt bildas i kroppen, antog vi att nivåerna av dessa proteiner borde stiga vid preeklampsi. För att få stöd för denna hypotes mätte vi halterna av proteinerna i blodplasma hos kvinnor med preeklampsi och jämförde med nivåerna hos normalgravida. I den första studien analyserades prov tagna från 28 patienter med preeklampsi och 27 friska kontroller i samband med förlossning. Resultaten bekräftade hypotesen: plasmakoncentrationerna av både HbF och A1M var förhöjda. Intressant nog uppmättes även förhöjningar av fritt adult Hb (HbA), dvs fritt hemoglobin som kommit från mammans hemolyserade blodkroppar [34]. Nivåerna av både HbF och HbA kunde korreleras till patienternas blodtryck och speglade därmed indirekt sjukdomens svårighetsgrad.
För att utvärdera den prediktiva potentialen av HbF som biomarkör undersöktes nivåerna av proteinet i maternellt blod i tidig graviditet. En kohort bestående av 96 patienter följdes under hela graviditeten, och ett serumprov togs i graviditetsvecka 10–16. Resultaten visade en signifikant skillnad (P<0,0001) mellan kontrollgruppen och de som senare utvecklade preeklampsi. För att ytterligare förbättra prediktionsvärdet kombinerade vi HbF med A1M, varvid sensitiviteten blev 69 procent när nivån av falskt positiva sattes till 5 procent. Optimal sensitivitet, 90 procent, erhölls vid 23 procent falskt positiva. Arean under kurvan (AUC) för ROC-kurvan (receiver operating characteristics) var 0,89 om de båda markörerna kombinerades [35]. Resultaten i denna studie visade tydligt att nivåerna av HbF är förhöjda redan i första trimestern hos de kvinnor som senare utvecklar preeklampsi och att plasmakoncentrationen av HbF och A1M potentiellt kan användas som framtida scree­ningmarkörer redan i första trimestern. Diskussion Etiologi. Våra resultat talar således för att fritt HbF kan ha en viktig roll i sjukdomens etiologi genom att orsaka skador på placentabarriären. A1M-nivåerna ökade i placenta vid pre­eklampsi som ett tecken på att placentan uppreglerar sitt försvar mot ökad oxidativ stress [34]. När den endogena produktionen av bindarproteiner och A1M inte räcker till uppstår skador på placentan. Fritt HbF läcker över placentabarriären till den maternella cirkulationen och bidrar där till systemisk oxidativ stress, hemolys av maternellt blod, inflammation, endotelskada och vasokonstriktion som ger generell organpåverkan (Figur 4).Andra biomarkörer. Kännetecknande för en bra sjukdomsbiomarkör är att den a) är involverad i sjukdomsmekanismerna, b) är mätbar före sjukdomsutbrottet, c) är korrelerad till sjukdomens allvarlighetsgrad och d) inte är mätbar eller endast uppvisar mycket låga nivåer vid ett normaltillstånd. Ett flertal biomarkörer för preeklampsi har tidigare utvärderats. Två angiogenesrelaterade faktorer är speciellt väl studerade: lösligt fms-liknande tyrosinkinas (sFlt-1), som är en löslig VEGF-receptor (vaskulär endoteltillväxtfaktor) och lösligt endoglin (sEng), en koreceptor för TGF-beta (tumör­nekrosfaktor). Båda är förhöjda i maternell plasma vid preeklampsi [36-39]. Förhöjda nivåer av sFlt-1 har påvisats innan de kliniska symtomen uppträder. Nivåerna korrelerar med tiden för debut av de kliniska manifestationerna och delvis med sjukdomens svårighetsgrad. Tidigt debuterande (early onset) preeklampsi är oftast allvarligare och uppvisar hög­re nivåer av sFlt-1 [36, 37, 40, 41]. Vidare har man i djurexperiment kunnat inducera protein­uri och hypertension och en svårare form av preeklampsi, det s k HELLP-syndromet (hemolysis, elevated liver enzymes, low platelet count), genom att infundera höga nivåer av sFlt och endoglin [42].Dopplerultraljud. Som en konsekvens av dålig placentation och försämrad kärlfunktion i placentan är blodflödet i den uteroplacentära cirkulationen reducerad och ojämn. Kliniskt kan flödesmotståndet i placentan mätas med hjälp av doppler­ultraljud [43]. Genom att mäta flödet i arteria uterina kan ett index som speglar kärlmotståndet beräknas. Vid ökat motstånd uppstår en s k notch (hack) på den registrerade flödeskurvan. Kvinnor som uppvisar ökat kärlmotstånd i båda uterusartärerna (bilateral notch) löper ökad risk att utveckla pre­eklampsi senare under graviditeten [44]. Bäst prediktivt värde för preeklampsi med dopplerultraljud erhålls om mätningarna görs i andra trimestern [45]. Dopplerultraljud har använts i kombination med ett flertal beskrivna markörer, framför allt kombinationen med placental growth factor (PLGF), sFlt och sEng, vilket givit en hög prediktionsnivå för tidigt debuterad preeklampsi [46, 47]. Trots detta är prediktionsvärdet för dessa markörer, i kombination med dopplerultraljud, lägre än för kombinationen av HbF och A1M utan dopplerultraljud. Främsta nackdelen med dopplerultraljud är att det är en avan­cerad och dyr metod, som inte lämpar sig för generell screening, speciellt inte i u-länder där man saknar tillgång till avancerad teknologi. Vidare kan man inte med dopplerultraljud särskilja preeklampsi från intrauterin tillväxthämning utan preeklampsi. Samma nackdelar gäller för sFlt-1, där höga nivåer har påvisats vid intrauterin tillväxthämning utan preeklampsi [48].Behandling. Oxidativ stress har föreslagits som orsaksmekanism till preeklampsi, och profylaktisk behandling med antioxidanterna vitamin C och E har studerats. Tyvärr har dessa studier inte kunnat påvisa någon skyddande effekt [49]. A1M har också antioxidativa egenskaper, men vid en jämförelse med vitamin C och E har A1M ytterligare egenskaper, t ex binder det hemgrupper, har högre molär kapacitet och effektiva clearance-mekanismer. Våra resultat visar förhöjd syntes av A1M i placentavävnad och ökad serumkoncentration vid preeklampsi. Detta talar för att A1M deltar i det naturliga försvaret mot den oxidativa stressen och den ökade nivån av fritt Hb. Vår behandlingshypotes, som bygger på att komplettera kroppens försvar med exogent tillfört A1M, stöds av resultaten från ex vivo-placentaperfusionsförsöken.Framtida forskning. Fortsatta studier inriktas nu på att studera behandlingseffekten av A1M i olika djurmodeller. Intressant nog uppvisar inga djur spontant preeklampsi, vilket komplicerar utvärderingen av A1M som potentiell farmakologisk behandling. I får och möss kan emellertid preeklampsi induceras, varför dessa djurmodeller kommer att användas för att studera behandlingseffekterna av A1M. * Potentiella bindningar eller jävsförhållanden: Stefan R Hansson och Bo Åkerström har sökt patent för diagnostik och behandling av preeklampsi. Stefan R Hansson, Magnus G Olsson, Magnus Centlow och Bo Åkerström har grundat företagen Preelumina Diagnostics AB och A1M Pharma AB.

Figur 1a.

Fgur 1b. Figur 1. Ackumulering av fritt fetalt hemoglobin (HbF) i placentakärllumen vid preeklampsi. Modifierad från Centlow et al [21].

Figur 2. Skiss över placentaperfusionsmodellen. Placentan monteras i perfusionskammaren, som håller en jämn temperatur på ca 37?°C. En buffrad näringslösning pumpas runt i den maternella re­spektive den fetala cirkulationen med reglerade pumphastigheter. Trycket i den fetala cirkulationen registreras kontinuerligt. Näringslösningen i den maternella cirkulationen syresätts med luft. Gasbalansen i den fetala cirkulationen hålls konstant med koldioxid och kvävgas. Modifierad från May et al [30].

Figur 3a. Placentära effekter av fetalt hemoglobin (HbF). Grafen (till höger) illustrerar läckaget av HbF från fostercirkulationen till den maternella cirkulationen vid perfusion med fritt Hb i den fetala cirkulationen (vinröd kurva). Vid samtidig tillsats av alfa-1-mikroglobulin (A1M) till den maternella cirkulationen upphör läckaget (blå kurva). Kontrollerna perfunderades med buffrad näringslösning (gul kurva) eller med enbart A1M i den maternella cirkulationen (grön kurva).

Figur 3b. Elektronmikroskopi visar intakta kollagenfib­rer i placentavävnad efter perfusion med buffrad näringslösning (n=3).

Figur 3c. Efter tillsats av fritt Hb till den fetala cirkulationen förstörs majoriteten av kollagenfibrerna (n=6).

Figur 3 d. Vid tillsats av A1M till den maternella cirkulationen återställs den ursprungliga ultramorfologin (n=4).Modifierad från May et al [30].